Revista Bioreview Edición 1 - Septiembre 2011

BIODIAGNOSTICO

 

Anticuerpos Anti-Dna: Evaluación de la Concordancia entre los Métodos de Quimioluminiscencia e Inmunofluorescencia

Dra. Gabriela Marina
Área Inmunología
Génesis – Manlab
gabriela.marina@genesis-manlab.com.ar
www.genesis-manlab.com.ar

Introducción

Los anticuerpos antiDNA son considerados marcadores de Lupus Eritematoso Sistémico (LES), su prevalencia en estos pacientes es de 40% a 80%. Bajos niveles de estos anticuerpos pueden estar presentes en otras enfermedades autoinmunes.

Existe una correlación entre los niveles de los anticuerpos anti-DNA y la actividad de la enfermedad. Por esta razón, es una herramienta para seguir la evolución de la enfermedad y eficacia del tratamiento.

Estos anticuerpos son capaces de fijar complemento, formando complejos que contienen secuencias de aminoácidos que les confiere su patogenicidad. Su presencia está relacionada con nefritis.

En general, se acepta que el Lupus Eritematoso Sistémico (LES) activo se asocia con predominio de anti-DNA doble cadena IgG y no de IgM o IgA. Okamura y colaboradores han demostrado una clara correlación entre anticuerpos IgG anti-DNA de doble cadena y la severidad del daño en la biopsia renal. En su estudio de 40 pacientes sin tratar, con nefritis lúpica, los niveles de estos anticuerpos fueron mayores en aquellos con nefritis clase IV que en los pacientes con clase I, II y III. Los anticuerpos IgM anti-DNA doble y simple cadena no se correlacionaron con daño histológico renal.

También se ha visto que la subclase de IgG puede ser importante por estar relacionada con su capacidad diferente para activar complemento, los anticuerpos isotipos IgG1 son considerados menos patógenos que los isotipos IgG2a, ya que son menos eficientes en la activación de complemento.

Diferentes técnicas han sido utilizadas para identificar la presencia de anticuerpos anti-DNA, como Radioinmunoensayo, con la técnica de Farr, Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ELISA y Quiminioluminiscencia (CLIA), con distintas sensibilidades y especificidades.

Objetivo

Se evalúa la concordancia entre dos ensayos inmunológicos para la determinación cuantitativa de anticuerpos anti-DNA doble cadena o nativo, Inmunofluorescencia Indirecta y Quimioluminiscencia, con el fin de valorar la posibilidad de integrar esta última a nuestro laboratorio.

Materiales y Métodos

Se analizaron 500 sueros remitidos a nuestro servicio, sin conocimiento de sus antecedentes. Se determinó la presencia de anticuerpos anti-DNA doble cadena por dos métodos, Inmunofluorescencia y Quimioluminiscencia.

En el método de Quimioluniscencia (CLIA), el ADN de doble cadena sintético se emplea para recubrir las partículas magnéticas y anticuerpos monoclonales de ratón anti IgG humana y están enlazados a un derivado de isoluminol. Este es enfrentado con los reactivos Starter que inducen la reacción de Quimioluminiscencia. Esta metodología se realizó con el instrumento LIAISON. Se tomó el cut off recomendado por el fabricante, menor a 25UI/mL. (LIAISON ds DNA).

Para realizar la técnica de Inmunofluorescencia, se utilizaron improntas de Crithidia luciliae (Biosystems), y conjugado de anti gammaglobulina IgG marcada con isotiocianato de fluoresceína (Biocientifica).

De las 500 muestras totales, resultaron coincidentes 20 muestras positivas y 470 muestras negativas, y 10 muestras fueron discordantes, siendo estas últimas positivas por CLIA y negativas por IFI. No se encontraron muestras negativas por CLIA y positivas por IFI. Del análisis de las muestras discordantes, se observaron nueve valores de CLIA entre 32,0 UI/mL y 69,6 UI/mL y uno de 125,6UI/mL. A todas estas muestras se les determinó la presencia de anticuerpos antinucleocitoplasmáticos, observándose en las muestras discordantes 5 resultados negativos, 4 positivos con patrón homogéneo y 1 positivo con patrón moteado fino.

Representamos a los verdaderos positivos como VP, a los verdaderos negativos como VN, a los falsos positivos como FP y a los falsos negativos como FN.

El análisis estadístico se realiza calculando el coeficiente de concordancia k (kappa), propuesto por Cohen, definido como:

Siendo Po la proporción de acuerdos observados:

Y Pe la proporción de acuerdos esperados en la hipótesis de independencia entre los métodos, es la proporción de acuerdos esperados por azar:

Landis y Koch propusieron la siguiente escala de valoración del k:

Conclusiones

No existe diferencia importante en los resultados obtenidos entre los métodos. En el estudio comparativo se ha demostrado un 79% de concordancia entre los dos métodos, con un grado de acuerdo sustancial.

La técnica de CLIA es una alternativa a tener en cuenta, ya que su automatización proporciona todas las ventajas bien conocidas de estos métodos, como fácil manejo de los aparatos, tubos primarios con códigos de barra, la posibilidad de realizar varios perfiles de pruebas a una misma muestra y resultados rápidos.

Creemos que esta técnica se puede adoptar, realizando un screening con ella. En el caso que fuese negativo se informa negativo, y si es positivo, se confirma el resultado con la técnica de anti-DNA por Inmunofluorescencia Indirecta y la determinación de anticuerpos antinucleocitoplasmáticos, informándose estos resultados.

Referencias Bibliográficas

  1. D. A. Isenberg, J. J. Manson, M. R. Ehrenstein and A. Rahman. Fifty years of anti-ds DNA antibodies: are we approaching journey' s end? Rheumatology 2007;46;1052–1056.

  2. D Isenberg, R Smeenk: Clinical laboratory assays for measuring anti-dsDNA antibodies. Where are we now? Lupus (2002) 11, 797-800

  3. Okamura M, Kanayama Y, Amastu K et al. Significance of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for antibodies to double stranded and single stranded DNA in patients with lupus nephritis: correlation with severity of renal histology. Ann Rheum Dis 1993;52:14–20.

  4. Cohen J. (1960) A coefficient of agreement for nominal scales. Educational and Psychological Measurement. 20:37-46.

  5. Landis J.R., Koch G.G. (1977) The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics 33:159-174.

Introducción

Los anticuerpos antiDNA son considerados marcadores de Lupus Eritematoso Sistémico (LES), su prevalencia en estos pacientes es de 40% a 80%. Bajos niveles de estos anticuerpos pueden estar presentes en otras enfermedades autoinmunes.

Existe una correlación entre los niveles de los anticuerpos anti-DNA y la actividad de la enfermedad. Por esta razón, es una herramienta para seguir la evolución de la enfermedad y eficacia del tratamiento.

Estos anticuerpos son capaces de fijar complemento, formando complejos que contienen secuencias de aminoácidos que les confiere su patogenicidad. Su presencia está relacionada con nefritis.

En general, se acepta que el Lupus Eritematoso Sistémico (LES) activo se asocia con predominio de anti-DNA doble cadena IgG y no de IgM o IgA. Okamura y colaboradores han demostrado una clara correlación entre anticuerpos IgG anti-DNA de doble cadena y la severidad del daño en la biopsia renal. En su estudio de 40 pacientes sin tratar, con nefritis lúpica, los niveles de estos anticuerpos fueron mayores en aquellos con nefritis clase IV que en los pacientes con clase I, II y III. Los anticuerpos IgM anti-DNA doble y simple cadena no se correlacionaron con daño histológico renal.

También se ha visto que la subclase de IgG puede ser importante por estar relacionada con su capacidad diferente para activar complemento, los anticuerpos isotipos IgG1 son considerados menos patógenos que los isotipos IgG2a, ya que son menos eficientes en la activación de complemento.

Diferentes técnicas han sido utilizadas para identificar la presencia de anticuerpos anti-DNA, como Radioinmunoensayo, con la técnica de Farr, Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), ELISA y Quiminioluminiscencia (CLIA), con distintas sensibilidades y especificidades.

Objetivo

Se evalúa la concordancia entre dos ensayos inmunológicos para la determinación cuantitativa de anticuerpos anti-DNA doble cadena o nativo, Inmunofluorescencia Indirecta y Quimioluminiscencia, con el fin de valorar la posibilidad de integrar esta última a nuestro laboratorio.

Materiales y Métodos

Se analizaron 500 sueros remitidos a nuestro servicio, sin conocimiento de sus antecedentes. Se determinó la presencia de anticuerpos anti-DNA doble cadena por dos métodos, Inmunofluorescencia y Quimioluminiscencia.

En el método de Quimioluniscencia (CLIA), el ADN de doble cadena sintético se emplea para recubrir las partículas magnéticas y anticuerpos monoclonales de ratón anti IgG humana y están enlazados a un derivado de isoluminol. Este es enfrentado con los reactivos Starter que inducen la reacción de Quimioluminiscencia. Esta metodología se realizó con el instrumento LIAISON. Se tomó el cut off recomendado por el fabricante, menor a 25UI/mL. (LIAISON ds DNA).

Para realizar la técnica de Inmunofluorescencia, se utilizaron improntas de Crithidia luciliae (Biosystems), y conjugado de anti gammaglobulina IgG marcada con isotiocianato de fluoresceína (Biocientifica).

De las 500 muestras totales, resultaron coincidentes 20 muestras positivas y 470 muestras negativas, y 10 muestras fueron discordantes, siendo estas últimas positivas por CLIA y negativas por IFI. No se encontraron muestras negativas por CLIA y positivas por IFI. Del análisis de las muestras discordantes, se observaron nueve valores de CLIA entre 32,0 UI/mL y 69,6 UI/mL y uno de 125,6UI/mL. A todas estas muestras se les determinó la presencia de anticuerpos antinucleocitoplasmáticos, observándose en las muestras discordantes 5 resultados negativos, 4 positivos con patrón homogéneo y 1 positivo con patrón moteado fino.

Representamos a los verdaderos positivos como VP, a los verdaderos negativos como VN, a los falsos positivos como FP y a los falsos negativos como FN.

El análisis estadístico se realiza calculando el coeficiente de concordancia k (kappa), propuesto por Cohen, definido como:

Siendo Po la proporción de acuerdos observados:

Y Pe la proporción de acuerdos esperados en la hipótesis de independencia entre los métodos, es la proporción de acuerdos esperados por azar:

Landis y Koch propusieron la siguiente escala de valoración del k:

Conclusiones

No existe diferencia importante en los resultados obtenidos entre los métodos. En el estudio comparativo se ha demostrado un 79% de concordancia entre los dos métodos, con un grado de acuerdo sustancial.

La técnica de CLIA es una alternativa a tener en cuenta, ya que su automatización proporciona todas las ventajas bien conocidas de estos métodos, como fácil manejo de los aparatos, tubos primarios con códigos de barra, la posibilidad de realizar varios perfiles de pruebas a una misma muestra y resultados rápidos.

Creemos que esta técnica se puede adoptar, realizando un screening con ella. En el caso que fuese negativo se informa negativo, y si es positivo, se confirma el resultado con la técnica de anti-DNA por Inmunofluorescencia Indirecta y la determinación de anticuerpos antinucleocitoplasmáticos, informándose estos resultados.

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