Revista Bioreview Edición 80 - Abril 2018

BIODIAGNOSTICO
LABORATORIO DE MEDICINA

 

Árbol de decisión para la determinación precisa del momento de la infección en individuos recientemente diagnosticados con infección por VIH-1

Chris Verhofstede,1 Katrien Fransen,2 Annelies Van Den Heuvel,2 Kristel Van Laethem,3,4 Jean Ruelle,5 Ellen Vancutsem,6 Karolien Stoffels,7
Sigi Van den Wijngaert,7 Marie-Luce Delforge,8 Dolores Vaira,9 Laura Hebberecht,1Marlies Schauvliege,1 Virginie Mortier,1 Kenny Dauwe,1
y Steven Callens10
BMC Infectious Diseases
Verhofstede et al. BMC Infectious Diseases (2017) 17:738
DOI 10.1186/s 12879-017-2850-6

Resumen

Antecedentes: Hoy en día no existe un método de referencia para definir con precisión el tiempo transcurrido desde la infección al momento del  diagnóstico de VIH. Sin embargo, la determinación del momento de la infección y de la incidencia es esencial para un mejor monitoreo de la  dinámica de las epidemias locales y de las iniciativas de prevención. 

Métodos: Se evaluaron tres métodos para la determinación del momento de la infección usando 237 muestras seriadas provenientes de  seroconversiones documentadas y 566 muestras transversales provenientes de pacientes recientemente diagnosticados: identificación de anticuerpos contra la proteína de VIH p31 en INNO-LIA, SediaTM BED CEIA y SediaTM LAg-Avidity EIA. Se desarrolló un árbol de decisión de  múltiples ensayos para la determinación del momento de la infección. 

Resultados: Se observaron claras diferencias en la ventana de infección reciente entre BED CEIA,  LAg-Avidity EIA y la presencia del anticuerpo  p31, con una alternancia de infección reciente a infección de larga duración, una mediana de 169.5, 108.0, y 64.5 días después de la recolección de la muestra previa a la seroconversión, respectivamente. BED mostró una alta confiabilidad para la identificación de infecciones de larga duración, mientras que LAg-Avidity es altamente preciso para la identificación de infecciones recientes. El usar BED como el ensayo inicial para identificar las infecciones de larga duración y el LAg-Avidity como un ensayo confirmatorio para aquellos clasificados por BED como infección reciente, explora las  fortalezas de ambos al tiempo que reduce la carga de trabajo. La corta ventana de infección reciente de los anticuerpos p31 permite discriminar a las infecciones muy tempranas de las tempranas, con base en este marcador. Se considera que los resultados de infección reciente obtenidos con BED y no confirmados por LAg-Avidity, reflejan un periodo más distante con respecto al momento de la infección. Las predicciones de proximidad falsas en este grupo pueden minimizarse mediante la eliminación de pacientes con un recuento de CD4 de menos de 100 células/ mm3 o sin anticuerpos anti p31. Para las 566 muestras transversales el resultado del árbol de decisión confirmó el momento de la infección con base en los resultados de los 3 marcadores, pero redujo el costo total de 13.2 USD a 5.2 USD por muestra. 

Conclusiones: Un árbol de decisión paso a paso de múltiples ensayos permite la determinación precisa del momento de la infección por VIH al momento del diagnóstico con un esfuerzo y costos asequibles y puede ser una nueva herramienta importante en los estudios que analizan la dinámica de las epidemias locales o los efectos de las estrategias de prevención. Palabras clave: VIH, momento de infección, medición de incidencia. 

Antecedentes  

La determinación de la incidencia de VIH es un instrumento esencial para el monitoreo confiable del efecto de las intervenciones preventivas como el tratamiento generalizado, el tratamiento temprano, la profilaxis previa a la exposición o las vacunas. La vigilancia del VIH en los países de Europa  occidental se basa principalmente en el reporte de casos de casos nuevos pero el definir la prevalencia de la infección es menos apropiado para rastrear las tendencias en la transmisión de VIH y está propenso al riesgo del sesgo que resulta de las variaciones en las tasas analíticas o cambios en la población en riesgo. ONUSIDA proporciona guías para la medición de la incidencia [1] y muchos países tienen programas para la medición de la incidencia nacional. A pesar de estos esfuerzos, aún hace falta un método de referencia para la determinación del momento de una infección por  VIH en el diagnóstico. La única vía confiable para clasificar una infección como reciente es la demostración de una seroconversión, pero el periodo  de seroconversión es corto y el diagnóstico de VIH frecuentemente se retrasa. Se han propuesto diferentes metodologías para la determinación de la incidencia de VIH, usando ya sea información de los ensayos diagnósticos de rutina [2], de ensayos especializados [3-5] o usando modelos  matemáticos [6]. Mientras que todos estos modelos pueden ser útiles para la determinación de la incidencia en poblaciones grandes, su valor para la estimación del momento de la infección en pacientes individuales está limitado. Asimismo, la multitud de estrategias usadas para la medición de la incidencia hoy en día obstaculiza la comparación de las tasas de incidencia entre estudios y países. 

Se han desarrollado diferentes ensayos que dependen de las características de la respuesta inmune humoral después de la infección para estimar  que tan reciente es está, como el incremento en la concentración relativa del anticuerpo IgG anti VIH con respecto a la concentración total de IgG y  el incremento en la afinidad del anticuerpo anti VIH. Idealmente, estos ensayos deberían tener una tasa de cálculo de proximidad de la infección  falso de menos del 2% [7]. El esfuerzo para lograr esta meta dificulta la implementación rutinaria de estos ensayos [7-11] y obliga a la exclusión de pacientes que se sabe tienen un mayor riesgo de obtener una clasificación de reciente falsa, para mejorar la exactitud. Alternativamente, las  ediciones de la incidencia pueden optimizarse mediante el uso de algoritmos que dependan de múltiples parámetros y como tales corrigen las  inexactitudes provenientes de los ensayos individuales.

El análisis sistemático de la incidencia también tiene implicaciones logísticas y financieras especialmente cuando se implican múltiples ensayos. Las estrategias de análisis en serie o árboles de decisión mantienen la exactitud, pero controlan los costos al reducir el número de muestras para un análisis amplio [12]. Son una solución interesante, pero necesitan ser diseñadas cuidadosamente para evitar la pérdida de información. El objetivo  de este estudio fue explorar diferentes esquemas analíticos para la medición de la incidencia de VIH y su vigilancia en Bélgica. Este país tiene una prevalencia relativamente alta de VIH con un número estable de 90 a 100 nuevos diagnósticos por millón de habitantes por año desde 2003. Los  hombres que tienen sexo con hombres representan el 46% de todos los diagnósticos nuevos, la transmisión heterosexual el 50%. 

Los migrantes de Africa subsahariana representan el 45% de los diagnósticos nuevos que resultan de contactos heterosexuales [13]. La heterogeneidad en cuanto al origen de los individuos infectados se refleja en que se encuentran representados una multitud de subtipos y recombinantes de VIH. La confirmación de una exploración inicial reactiva para VIH está centralizada en 7 laboratorios de referencia que reportan los nuevos diagnósticos cifrados al instituto de Salud Pública. Los laboratorios de referencia también están a cargo del monitoreo de laboratorio de los pacientes infectados con VIH y como tal tienen acceso a los datos de carga viral y de recuento de CD4 para todos los pacientes que ingresan a atención. 

Se evaluaron los  siguientes marcadores de momento de la infección: ausencia de anticuerpos contra el antígeno p31 de VIH- 1 como se visualiza en la prueba confirmatoria de inmunoblot (INNO-LIA HIV I/II Score, Fujirebio, Ghent, Bélgica), concentración baja de IgG VIH como la define el inmunoensayo enzimático de incidencia SediaTM BED HIV-1 (BED-CEIA; Sedia Biosciences Corporation, Portland Oregón, EUA), baja avidez por anticuerpos de VIH como la define el inmunoensayo enzimático de avidez por el antígeno VIH-1 restrictivo (LAg-Avidity EIA; Sedia Biosciences Corporation). Se definieron las fortalezas y debilidades de dichos marcadores solos y en combinación en muestras seriadas de pacientes seroconvertidos o en muestras de pacientes con condiciones particulares y en muestras transversales de la población objetivo. Con base en los resultados obtenidos se desarrolló un árbol de decisión para la determinación futura del momento de la infección. 

Métodos 

Población estudiada

La Tabla 1 presenta una visión general de las características de los pacientes para las diferentes series de muestras. 

Tabla 1. Características de los pacientes en las diferentes series de muestras

Las series de muestras longitudinales comprendieron 237 muestras de plasma en serie de 42 pacientes con seroconversión documentada. El número promedio de muestras analizadas por paciente fue de 7 (intervalo de 4 a 15) y la media del periodo de seguimiento total fue de 696 días (intervalo 67 a 2364 días). La primera muestra recolectada de cada paciente (día 0) mostró una prueba reactiva para antígeno p24, pero no mostró anticuerpos detectables en el  INNO-LIA HIV I/II Score.

Las series de muestras transversales consistieron en muestras individuales recolectadas al momento del diagnóstico o máximo 6 semanas después, partir de ese punto, de 566 individuos diagnosticados con VIH-1 en Bélgica entre 2012 y 2014. En todos los casos los pacientes no habían recibido  tratamiento y tener una carga viral detectable (> 20 c/ml) al momento de la recolección de la muestra. El subtipo de VIH estaba disponible para 511 individuos, la mayoría (53.0%) estaban infectados con un subtipo B del virus. Los demás subtipos y formas recombinante circulantes (CFR)  representadas fueron CRF02_AG (n = 74), F (n = 63), A (n = 33), C (n = 26), CRF01_AE (n = 17), G (n = 11), otras CRF (n = 9) y D (n = 7). 

Las series de muestras de pacientes con una condición particular que se sabía estaba asociada con una probabilidad mayor de predicción del  proximidad de la infección falsa, contenían muestras individuales de 12 pacientes bajo tratamiento antirretroviral (TAR) (tratados durante al menos 6  meses, carga viral < 20 copias/ ml (c/ml)), de 11 controladores élite (infectados durante al menos 4 años, sin tratamiento, con carga viral entre 20 y  1000 c/ml) y de 19 infecciones avanzadas (infectados por más de 5 años, carga viral > 30,000 c/ml, recuento de CD4 < 100 células/mm3). 

Todas las muestras fueron seleccionadas del almacén de suero y plasma de los 7 laboratorios belgas de referencia para Sida. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de las instituciones participantes siendo el hospital Universitario de Ghent el centro líder (número de estudio 2014/0717). 

INNO-LIA y anticuerpos p31 

El ensayo INNO-LIA HIV I/II Score (Fujirebio) fue realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Usando la intensidad de banda de los  tres estándares internos, se calificó la reacción del anticuerpo a los antígenos individuales de VIH como -, ±, 1+, 2+ o 3+, ya fuera visualmente o por  el sistema de lectura automatizado LIRAS (Fujirebio). Los anticuerpos contra la proteína integrasa p31 se consideraron ausentes cuando se otorgaba una puntuación de – o de ± y presentes cuando la puntuación era de 1+ o mayor. Para las muestras longitudinales, el INNO-LIA se realizó  en muestras en serie hasta que se documentara la presencia de anticuerpos p31. Para las muestras de las poblaciones seleccionadas se realizó un  INNO-LIA en el contexto de este estudio, para las muestras transversales de pacientes recientemente diagnosticados se usaron los resultados del  ensayo diagnóstico. 

LAg-Avidity IEA y BED CEIA 

El SediaTM BED CEIA (Sedia Biosciences Corporation, Portland, Oregon, EUA) y el SediaTM HIV-a LAg-Avidity EIA (Sedia Biosciences  Corporation), se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se normalizaron usando un calibrador interno y se  reportaron como densidades ópticas normalizadas (DO-n). La atribución de infecciones de larga duración se basó en una sola medición y en una  DO-n > 1.2 para BED CEIA o > 2.0 para el LAg-Avidity EIA. Para muestras con una DO-n ≤ a sus respectivos valores de corte, se realizó un  preanálisis por triplicado como se recomienda y la discriminación entre la infección reciente y de larga duración se basó en una mediana de DO-n >  0.8 para BED CEIA y > 1.5 para LAg-Avidity EIA. 

Asignación del subtipo 

Se usaron secuencias de genes de proteasa y de transcriptasa inversa de VIH-1 agrupados con el fin de evaluar la resistencia basal para la  asignación del subtipo usando Rega v3, http://dbpartners.stanford.edu:8080/RegaSubtyping/ stanford-hiv/typingtool/ (Instituto Rega 
para la Investigación Médica, Lovaina, Bélgica) [14] y Comet, http://comet.retrovirology.lu/ (Laboratorio de Retrovirología, Instituto de Salud de  Luxemburgo, Luxemburgo) [15]. El subtipo sólo se asignó en caso de un resultado concordante de ambas herramientas y se consideró como  indefinido (UD) en caso de discordancia. Se asignaron a las secuencias los números ascendentes de Genbank MF754381 a MF754919. 

Análisis estadístico

Se usó la prueba de generalización extrema de la t de student de Rosner (ESD) con un nivel de significancia establecido en 0.05 para identificar los  típicos (https://www.medcalc.org/manual/outliers.php; último acceso el 29 de noviembre de 2007). Se usó la prueba exacta de Fisher para comparar  la representación de pacientes con un recuento bajo de CD4 contra las predicciones congruentes e incongruentes.  

Resultados 

Muestras en serie de seroconvertidos 

Para el estudio longitudinal, la fecha de recolección de la primera muestra (previo a la seroconversión) se consideró como día 0. Los anticuerpos  contra el antígeno p31 estuvieron ausentes en 28.7% de las muestras y fueron detectados por primera vez en una muestra recabada en el día 32. La mediana del intervalo temporal entre la última muestra sin anticuerpos p31 y la primera muestra con anticuerpos p31 fue el día 64.5 (IQR 33.5 –  89.0) (Fig. 1a). Con el LAg-Avidity EIA, 38.8% de las muestras en serie fueron clasificadas como recientes y 61.2% como de larga duración (Fig.1b).  Las muestras de infecciones recientes fueron recolectadas entre el día 0 y el 406. La mediana del punto de tiempo entre las clasificaciones de reciente y de larga duración fue el día 108.0 (IQR 89.5 – 157.5) (Fig. 1b). Con el BED CEIA, 50.0% de las muestras fueron clasificadas como  recientes y 50.0% como de larga duración (una muestra no fue analizada con el BED CEIA). Las infecciones recientes fueron recolectadas entre el día 0 y el 1053. La mediana del punto de tiempo entre la clasificación de reciente y de larga duración fue el día 169.5 (IQR 108.0 – 234.45) (Fig. 1c). 

Fig. 1 Resultados de la presencia del anticuerpo p31 (a), LAg-Avidity EIA, (b) BED CEIA (c) y el árbol de decisión (c) en seroconvertidos. Las  gráficas de dispersión representan la intensidad del p31 en las tiras INNO-LIA (a), la densidad óptica normalizada para el LAg-Avidity EIA (b), la  densidad óptica normalizada para el BED CEIA (c) y la clasificación del árbol de decisión (d) para 237 muestras de 42 seronconvertidos. La fecha de la primera muestra, recabada previo a la seroconversión, se considera como día 0. Los diamantes azules representan la clasificación como  infección reciente; los diamantes rojos representan clasificación como infección de larga duración. 

La Figura 2a representa la evolución de los resultados del ensayo través del tiempo en un paciente representativo (paciente PO). La prueba ESD de  Rosner identificó 7 atípicos para los anticuerpos p31, 3 para el LAg-Avidity EIA y 2 para BED CEIA. Se observó ausencia de anticuerpos p31 en muestras recolectadas en el día 89, 122, 167, 267, 386, 524 y 599 reflejando una producción retardada de anticuerpos p31 en 3 pacientes de  quienes fueron obtenidos: paciente 79 (Fig. 2b), paciente 83 (Fig. 2c) y paciente 09 (Fig. 2d). El LAg-Avidity EIA clasificó equivocadamente una  muestra recolectada en el día 0 como infección de larga duración: paciente GU (Fig. 2e) y 2 muestras recolectadas del paciente 83 en el día 214 y  406 como infección reciente (Fig. 2c) y una muestra del día 1053 (paciente 11, Fig. 2f) como infección reciente. 

Fig. 2. Resultados del ensayo en función del tiempo desde la recolección de la primera muestra para 6 pacientes demostrativos. a representa la evolución de los marcadores en un paciente representativo (PO) y de b a f representan la evolución en todos los pacientes con al menos un  resultado atípico. Estrellas negras: ausencia de anticuerpos p31; triángulos negros: presencia de anticuerpos p31. Círculos azules: resultados del  BED CEIA, círculos vacíos: infección reciente, círculos rellenos: infección de larga duración. Diamantes rojos: resultados del LAg-Avidity EIA;  diamantes vacíos: infección reciente, diamantes rellenos: infección de larga duración. Línea negra: evolución de la carga viral. Los cuadros en la  parte superior de las gráficas representan los resultados obtenidos cuando se siguió el árbol de decisión, amarillo: infección muy temprana,  anaranjado: infección temprana, verde: infección reciente, morado: infección de larga duración, y café: infección avanzada.

Los 5 pacientes con resultados atípicos estaban infectados con un subtipo B del virus. Tres de los 4 pacientes con una ventana de proximidad de la infección prolongada ya fuera para ambos EIAs y para los anticuerpos p31 (paciente 83, Fig. 2d), sólo para el BED CEIA (paciente 11, Fig. 2e) o solo para los anticuerpos p31 (pacientes 79, Fig. 2f) también mostraron un control viral pronunciado después de la infección aguda en ausencia de TARc. En la Tabla 2 se resume la sensibilidad global y la especificidad de los dos ensayos EIA cuando se aplican diferentes cortes para la duración de la infección. 

Tabla 2. Sensibilidad y especificidad de LAg-Avidity, BED y del árbol de decisión para muestras longitudinales de seroconvertidos. Se aplicaron  diferentes ventanas de infección reciente cambiando el corte para la duración de la infección. La duración de la infección es el periodo (en días)  después de la recolección de la primera muestra previa a la seroconversión. Infección reciente: muestras tomadas antes del corte establecido para  duración de la infección. Infección de larga duración: muestras tomadas en el corte para duración de la infección o después de este. Para el árbol de  decisión, todos los resultados de “muy temprana” o “temprana” fueron consideradas como recientes (clasificación 1) o todos los resultados de “muy  temprana”, “temprana” y “reciente” fueron consideradas como recientes (clasificación 2). 

Cabe hacer notar que 2 pacientes que iniciaron con TARc durante la fase aguda de la infección mostraron una ventana de proximidad de la infección prolongada para los 3 marcadores (analizado fuera del estudio, no se muestran los resultados). 

Controladores élite, pacientes con progresión lenta, tratados con TAR y pacientes con etapas tardías de la enfermedad 

Se observaron altas tasas de predicciones falsas de reciente en los pacientes recibiendo TAR y en controladores élite (Tabla 3), con el BED CEIA presentando la mayoría de este tipo de clasificaciones equivocadas, seguido del  Ag-Avidity EIA y de los anticuerpos p31. La enfermedad avanzada y un recuento bajo de CD4 también se asociaron con un mayor número de predicciones falsas de reciente en el BED CEIA y el ensayo de anticuerpos p31, pero no así en el LAg-Avidity (Tabla 3). No se observaron clasificaciones falsas de reciente para los pacientes con progresión lenta. 

Tabla 3. Predicciones falsas de proximidad de la infección en poblaciones especiales

Individuos recientemente diagnosticados 

En la Tabla 4 se muestran los  resultados de 566 muestras transversales de pacientes recientemente diagnosticados. Se obtuvieron clasificaciones de infección reciente  concordantes para los 3 marcadores para 105 (18.9%) pacientes y clasificaciones de infección de larga duración concordantes para 313 (55.3%), resultando en una concordancia global de 73.9%. 

Tabla 4. Resultados del momento de la infección para muestras transversales de 566 individuos recientemente diagnosticados

Al comparar los resultados de los dos EIAs, la concordancia fue de 85.3%, con 28.4% de las muestras clasificadas como infecciones recientes y 56.9% como infecciones de larga duración. Se observaron discordancias entre los resultados del EIA para 83 pacientes (14.7%), 82 clasificados  como recientes por BED y de larga duración por el LAg-Avidity y 1 clasificado como reciente por el LAg-Avidity y de larga duración por BED. 

Para los análisis subsecuentes, los resultados que siguieron las expectativas considerando las diferencias en la ventana de infección reciente entre los ensayos, se nombraron congruentes y los resultados que no pudieron explicarse por la ventana de infección reciente se nombraron incongruentes (Tabla 4). El número total de predicciones incongruentes fue bajo (n = 18, 3.2%) siendo que el número más alto resultó de predicciones falsas de infección reciente, 17 para anticuerpos p31, 8 para BED CEIA y 1 para LAg-Avidity EIA. 

Para identificar adicionalmente los motivos de las incongruencias, se compararon la carga viral y la distribución del subtipo entre los grupos de clasificación. Los resultados mostraron que las incongruencias se observaron en forma significativamente más frecuente en pacientes con un recuento bajo de CD4 (< 200 células/ mm3; p < 0.01) pero ni la influencia de la carga viral ni la del subtipo fueron significativas. Cabe hacer notar que 7 de los 9 pacientes clasificados como infecciones de larga duración por ambos EIAs, pero en quienes estuvieron ausentes los anticuerpos p31, fueron infecciones del subtipo B. 

Adaptación de los cortes para el reanálisis por triplicado 

El protocolo estándar para el BED CEIA y el LAg-Avidity EIA recomiendan el reanálisis por  triplicado para todas las muestras con una DO-n de ≤ 1.2 ≤ 2.0 respectivamente. El valor agregado de esta prueba confirmatoria fue investigado analizando el número de muestras con una conclusión  diferente después del análisis por triplicado a la obtenida si sólo se hubiera tomado en cuenta el resultado de la prueba realizada una sola vez. Éste fue el caso para 4 muestras para BED CEIA y 13 muestras para el LAg-Avidity EIA. Estas muestras tuvieron una DO-n de la prueba única entre  0.706 y 0.881 para el BED CEIA y entre 1.160 y 1.553 para el LAg-Avidity EIA. Por lo tanto, para el árbol de decisión nos sentimos confiados de estrechar el intervalo de la DO-n que requeriría de un reanálisis confirmatorio a ≤ 1.000 y > 0.700 para BED y ≤ 1.600 y > 1.100 para el LAg-Avidity. 

Árbol de decisión 

Con base en la información reunida se diseñó un árbol de decisión de múltiples ensayos para la determinación del momento de la infección en el  diagnóstico en pacientes que no hubiera recibido tratamiento con una carga viral detectable (Fig. 3). El paso inicial es la identificación de muestras  previas a la seroconversión (con INNO-LIA negativo o indeterminado) y la clasificación inmediata de estos pacientes como infecciones agudas.  posteriormente todas las muestras restantes son analizadas con el BED CEIA usando los cortes adaptados para el reanálisis por triplicado para  identificar infecciones de larga duración. Las muestras predichas por el BED CEIA como infectadas recientemente son entonces analizadas en el  LAg-Avidity EIA. Los resultados del LAg-Avidity se interpretan junto con la información sobre la presencia o ausencia de anticuerpos p31 para  identificar pacientes con una infección “muy temprana” (ambos EIAs indicando infección reciente, anticuerpos p31 aún ausentes) y pacientes con  infección “temprana” (ambos EIAs indicando infección reciente, anticuerpos p31 presentes). Las muestras con un pronóstico de BED de reciente –  LAg-Avidity de larga duración, son consideradas como recolectadas en una etapa de la infección ligeramente más avanzada llamada “reciente”. Esta última clasificación es más propensa a errores. Para reducir el número de clasificaciones de infecciones recientes falsas, las muestras en estas  categorías sin anticuerpos p31 o con un recuento de CD4 de < 100 células/mm3 son reclasificadas como infecciones presumiblemente avanzadas.  Considerando  las ventanas de infección reciente calculadas para ambos EIA y para anticuerpos p31 se estima que la clasificación de muy temprana represente infecciones de menos de 3 meses, la clasificación de temprana de menos de 4 meses y la clasificación de reciente de menos de 6  meses. Para las muestras en serie provenientes de seroconvertidos, el árbol de decisión fue capaz de identificar el momento de la infección con una  sensibilidad y especificidad idéntica o mayor a la sensibilidad y especificidad obtenida con los ensayos individuales. Los resultados obtenidos  después de la simulación del árbol de decisión para las muestras transversales se muestran en la Tabla 4. Para estas 566 muestras transversales, la aplicación del árbol de decisión hubiera reducido el número de pruebas individuales en un 29.8% y de los análisis por triplicado en un 84.2%  resultando en una reducción estimada de costos por muestra de 13.2 USD a 5.2 USD, sin pérdida de información. 

Fig. 3. Árbol de decisión para determinar el momento de la infección

Discusión 

La infección aguda por VIH-1 se caracteriza por la presencia de antígenos virales o de ARN viral en ausencia de anticuerpos específicos y puede ser reconocida fácilmente con base en los resultados de ensayos diagnósticos realizados en forma rutinaria [16]. 

El surgimiento secuencial de la reactividad en diferentes pruebas diagnósticas ha sido usado como una herramienta por Fiebig et al para establecer  la etapa de la infección primaria [17]. Sin embargo, la etapa aguda previa a la seroconversión es corta, considerándose que dura entre 12 y 99 días 18], y la mayoría de las infecciones son diagnosticadas posteriormente. Se ha dedicado un esfuerzo considerable para la validación de métodos o  estrategias que permitan una estimación confiable del momento de la infección en el diagnóstico posterior a la seroconversión. La bibliografía sobre este tema es amplia, pero carece de consistencia, con respecto a los métodos aplicados, los ensayos usados y la población de pacientes analizada. A pesar de muchos esfuerzos, aún hace falta un método de referencia aceptado en forma general para establecer el momento de la infección. Por lo tanto, cualquier iniciativa para la medición de la incidencia de VIH requiere de una validación apropiada de las estrategias potenciales en muestras recolectadas de la población objetivo, prevista. 

La meta del presente estudio fue desarrollar un método para establecer el  momento de la infección en pacientes recientemente diagnosticados con infección por VIH-1 en Bélgica. El objetivo fue encontrar una estrategia que permita la medición de la incidencia, pero también facultara el establecimiento confiable del momento de la infección en pacientes individuales. Esta  última debe facilitar una caracterización más profunda de los pacientes que ingresan a atención, una mejor identificación de los motivos  para un  diagnóstico tardío y una mejor comprensión del periodo durante el cual un paciente es más vulnerable para transmitir el virus a un tercero. Esta  información es importante para el seguimiento, ajuste y mejoría de los esfuerzos de prevención. 

Las diferencias individuales entre los pacientes y la composición de la población usada para la validación pueden, en cierto grado, influenciar la media de la ventana de infección reciente. Por ejemplo, observamos ventanas de infección reciente más prolongadas en pacientes que eran capaces de controlar la carga viral en un punto inferior en poco después de la infección. Los EIAs de incidencia de fabricantes diferentes pueden tener ventanas de infección reciente diferentes, incluso si están analizando el mismo parámetro y también puede diferir el método usado para el cálculo de la ventana de infección reciente 

Dado que la ventana de infección reciente impacta altamente las tasas de incidencia calculadas, esta es un factor esencial por considerar al decidir sobre el uso de un ensayo para el cálculo del momento de la infección. La ventana de infección reciente ideal para el cálculo de la incidencia es de un año, pero ninguno de los marcadores evaluados alcanzó ese tiempo límite. El DEB CEIA tiene la ventana de infección reciente más amplia y por  lo tanto parecer más adecuado, pero como observamos nosotros y otras personas, es también el ensayo con la tasa de infección reciente falsa más alta [22-24]. En una publicación reciente Kassanjee et al. sugirieron optimizar las ventanas de infección reciente de los inmunoensayos afinando los  umbrales [25]. Esta estrategia que también fue explorada por Konikoff et al. [26] amerita mayor exploración. 

Para minimizar las clasificaciones falsas, el fabricante del BED CEIA recomienda la exclusión de individuos recibiendo TAR, supresores élite e individuos con un recuento de CD4 < 200 células/mm3. mientras que nuestros hallazgos respaldan la importancia de excluir a los pacientes con una carga viral indetectable, el valor agregado de eliminar a los pacientes con un recuento de CD4 < 200 es debatible. A pesar de que esto eliminaría parte de las predicciones falsas de reciente en una infección avanzada [27], no las excluiría todas. Además, debido a que los recuentos de CD4 pueden caer ocasionalmente por abajo de las 200 células/mm3 después de la infección aguda [28,29], la exclusión de pacientes con un recuento bajo de CD4 puede impactar los números de infecciones recientes. Por lo tanto, optamos por reclasificar solamente como infecciones avanzadas a aquellos pacientes con un recuento de CD4 de menos de 100 células/mm3 que solo el BED CEIA consideró como infectados recientemente. Las predicciones de reciente falsas del BED EIA en etapa avanzada de la infección pueden explicarse por la reducción de concentración de anticuerpos de VIH con la progresión de la enfermedad [30]. Esta disminución en la concentración de anticuerpo también puede llevar a la desaparición de los anticuerpos p31, pero parece tener poco efecto sobre la afinidad por los anticuerpos en general. Por lo tanto, las predicciones de reciente falsas en los pacientes con una etapa tardía de la enfermedad son raras para el LAg-Avidity EIA [7, 19, 31]. En el árbol de decisión, la ausencia de anticuerpos p31 en pacientes considerados como recientemente infectados sólo por BED CEIA se considera indicativo de una etapa avanzada de la infección. Sin embargo, no podemos excluir que aquellos pacientes que no montan una respuesta de anticuerpos p31 o con una producción tardía de anticuerpos p31 como un paciente en el estudio longitudinal, sean considerados falsamente como teniendo una enfermedad avanzada, pero dado que esto se considera un fenómeno raro creemos que este error potencial no sobrepasa la ganancia global en la confiabilidad del cálculo del momento de la infección. 

La elección del BED CEIA en primera línea se justifica por su alta confiabilidad para la identificación de infección de larga duración y su bajo precio  (aproximadamente  450 USD por kit contra 650 para el LAg-Avidity EIA). El uso del BED CEIA en primera línea también permite beneficiarse de la ventana de infección reciente más amplia de este ensayo y proporciona una forma para discriminar entre las infecciones “tempranas” y “recientes”.   Las clasificaciones de infección “muy temprana” o “temprana” siempre se basarán en un pronóstico de infección reciente obtenido por ambos EIAs y  por lo tanto serán altamente confiables. La clasificación de infección “reciente” se basará únicamente en un pronóstico de infección reciente del BED  CEIA un ensayo con una tasa de infección reciente falsa elevada. A pesar de la corrección para predicciones de infección reciente falsa basada en el recuento de CD4 y en la presencia o ausencia de anticuerpos p31 esta categoría puede sufrir de algunas clasificaciones erróneas. Para este estudio  a información sobre la presencia o ausencia de anticuerpos p31 se deduce del ensayo confirmatorio INNO-LIA. Necesitaría  examinarse si el ensayo inmunocromatográfico más recientemente desarrollado, Ensayo suplementario GeeniusTM HIV ½ (Biorad, Marnes-la-Coquette, Francia) puede servir para este fin. 

Este estudio fue desarrollado en un país con una epidemia de VIH heterogénea [13, 32]. Existen algunos reportes acerca de diferencias relacionadas con el subtipo en el desempeño de los EIAs de incidencia, más particularmente se ha descrito una alta frecuencia de pronósticos de reciente falsos realizados por el BED CEIA en el subtipo D [33, 34]. Nosotros no encontramos indicaciones de la influencia del subtipo sobre el  momento de la infección, pero la contribución del subtipo D fue baja. De las 7 infecciones de subtipo D, 3 fueron pronosticadas como de larga duración, 1 como muy temprana y 1 como reciente. Inesperadamente, se observó una mayor contribución de las infecciones de subtipo B entre los pacientes pronosticados como infectados durante largo tiempo por ambos EIAs pero que carecían de anticuerpos p31. La sobrerrepresentación del  subtipo B en estos pacientes con una enfermedad avanzada presumible no fue estadísticamente significativa, pero justifica una ulterior investigación.

Cualquier medición de incidencia que se base en características específicas de la respuesta inmune humoral estará propensa error debido a la  variabilidad natural en la producción y maduración de anticuerpos. Se ha sugerido a la cuantificación de la variabilidad genética del virus como un  marcador alternativo del momento de la infección [35] pero los métodos para definir la variabilidad genética son complicados y difíciles de  estandarizar y puede esperarse que el grado de evolución genética también varíe significativamente entre los individuos. 

Anteriormente se han presentado algoritmos de análisis para la medición de la incidencia de VIH [12, 36]. Usando esta metodología desarrollamos un árbol de decisión que, con un esfuerzo y costos limitados, combine la exactitud y la precisión para definir el momento de la infección por VIH-1 en muestras individuales. 

Conclusión 

Tomando en cuenta las fortalezas y debilidades de los diferentes marcadores del momento de la infección, se estableció un árbol de decisión paso a  paso que permite clasificar, en el momento del diagnóstico, una infección por VIH como muy temprana (infección de hace menos de 3 meses), temprana (de hace menos de 4 meses), y reciente (de hace menos de 6 meses). El ser capaces de discriminar estas fases de la infección temprana  será un recurso importante en los estudios cuyo objetivo sea analizar la dinámica de las epidemias locales y los efectos de las estrategias de  prevención. 

Abreviaturas TAR: tratamiento antirretroviral; BED: antígeno de VIH subtipo B, E y D; CD4 Clúster de diferenciación 4, CEIA: inmunoensayo  enzimático de captura; EIA: inmunoensayo enzimático; ESD: desviación extrema de la t de Student; VIH: virus de inmunodeficiencia humana; INNO-LIA: inmunoensayo lineal de Innogenetics, IQR: rango interquartil, DO: densidad óptica; DO-n: densidad óptica normalizada; P24: proteína 24 de VIH (proteína de la cápside): P31 proteína de VIH (íntegrasa), ONUSIDA: Programa de las Naciones Unidas sobre VIH/SIDA; USD: Dólar estadounidense. 

Resumen

Antecedentes: Hoy en día no existe un método de referencia para definir con precisión el tiempo transcurrido desde la infección al momento del  diagnóstico de VIH. Sin embargo, la determinación del momento de la infección y de la incidencia es esencial para un mejor monitoreo de la  dinámica de las epidemias locales y de las iniciativas de prevención. 

Métodos: Se evaluaron tres métodos para la determinación del momento de la infección usando 237 muestras seriadas provenientes de  seroconversiones documentadas y 566 muestras transversales provenientes de pacientes recientemente diagnosticados: identificación de anticuerpos contra la proteína de VIH p31 en INNO-LIA, SediaTM BED CEIA y SediaTM LAg-Avidity EIA. Se desarrolló un árbol de decisión de  múltiples ensayos para la determinación del momento de la infección. 

Resultados: Se observaron claras diferencias en la ventana de infección reciente entre BED CEIA,  LAg-Avidity EIA y la presencia del anticuerpo  p31, con una alternancia de infección reciente a infección de larga duración, una mediana de 169.5, 108.0, y 64.5 días después de la recolección de la muestra previa a la seroconversión, respectivamente. BED mostró una alta confiabilidad para la identificación de infecciones de larga duración, mientras que LAg-Avidity es altamente preciso para la identificación de infecciones recientes. El usar BED como el ensayo inicial para identificar las infecciones de larga duración y el LAg-Avidity como un ensayo confirmatorio para aquellos clasificados por BED como infección reciente, explora las  fortalezas de ambos al tiempo que reduce la carga de trabajo. La corta ventana de infección reciente de los anticuerpos p31 permite discriminar a las infecciones muy tempranas de las tempranas, con base en este marcador. Se considera que los resultados de infección reciente obtenidos con BED y no confirmados por LAg-Avidity, reflejan un periodo más distante con respecto al momento de la infección. Las predicciones de proximidad falsas en este grupo pueden minimizarse mediante la eliminación de pacientes con un recuento de CD4 de menos de 100 células/ mm3 o sin anticuerpos anti p31. Para las 566 muestras transversales el resultado del árbol de decisión confirmó el momento de la infección con base en los resultados de los 3 marcadores, pero redujo el costo total de 13.2 USD a 5.2 USD por muestra. 

Conclusiones: Un árbol de decisión paso a paso de múltiples ensayos permite la determinación precisa del momento de la infección por VIH al momento del diagnóstico con un esfuerzo y costos asequibles y puede ser una nueva herramienta importante en los estudios que analizan la dinámica de las epidemias locales o los efectos de las estrategias de prevención. Palabras clave: VIH, momento de infección, medición de incidencia. 

Antecedentes  

La determinación de la incidencia de VIH es un instrumento esencial para el monitoreo confiable del efecto de las intervenciones preventivas como el tratamiento generalizado, el tratamiento temprano, la profilaxis previa a la exposición o las vacunas. La vigilancia del VIH en los países de Europa  occidental se basa principalmente en el reporte de casos de casos nuevos pero el definir la prevalencia de la infección es menos apropiado para rastrear las tendencias en la transmisión de VIH y está propenso al riesgo del sesgo que resulta de las variaciones en las tasas analíticas o cambios en la población en riesgo. ONUSIDA proporciona guías para la medición de la incidencia [1] y muchos países tienen programas para la medición de la incidencia nacional. A pesar de estos esfuerzos, aún hace falta un método de referencia para la determinación del momento de una infección por  VIH en el diagnóstico. La única vía confiable para clasificar una infección como reciente es la demostración de una seroconversión, pero el periodo  de seroconversión es corto y el diagnóstico de VIH frecuentemente se retrasa. Se han propuesto diferentes metodologías para la determinación de la incidencia de VIH, usando ya sea información de los ensayos diagnósticos de rutina [2], de ensayos especializados [3-5] o usando modelos  matemáticos [6]. Mientras que todos estos modelos pueden ser útiles para la determinación de la incidencia en poblaciones grandes, su valor para la estimación del momento de la infección en pacientes individuales está limitado. Asimismo, la multitud de estrategias usadas para la medición de la incidencia hoy en día obstaculiza la comparación de las tasas de incidencia entre estudios y países. 

Se han desarrollado diferentes ensayos que dependen de las características de la respuesta inmune humoral después de la infección para estimar  que tan reciente es está, como el incremento en la concentración relativa del anticuerpo IgG anti VIH con respecto a la concentración total de IgG y  el incremento en la afinidad del anticuerpo anti VIH. Idealmente, estos ensayos deberían tener una tasa de cálculo de proximidad de la infección  falso de menos del 2% [7]. El esfuerzo para lograr esta meta dificulta la implementación rutinaria de estos ensayos [7-11] y obliga a la exclusión de pacientes que se sabe tienen un mayor riesgo de obtener una clasificación de reciente falsa, para mejorar la exactitud. Alternativamente, las  ediciones de la incidencia pueden optimizarse mediante el uso de algoritmos que dependan de múltiples parámetros y como tales corrigen las  inexactitudes provenientes de los ensayos individuales.

El análisis sistemático de la incidencia también tiene implicaciones logísticas y financieras especialmente cuando se implican múltiples ensayos. Las estrategias de análisis en serie o árboles de decisión mantienen la exactitud, pero controlan los costos al reducir el número de muestras para un análisis amplio [12]. Son una solución interesante, pero necesitan ser diseñadas cuidadosamente para evitar la pérdida de información. El objetivo  de este estudio fue explorar diferentes esquemas analíticos para la medición de la incidencia de VIH y su vigilancia en Bélgica. Este país tiene una prevalencia relativamente alta de VIH con un número estable de 90 a 100 nuevos diagnósticos por millón de habitantes por año desde 2003. Los  hombres que tienen sexo con hombres representan el 46% de todos los diagnósticos nuevos, la transmisión heterosexual el 50%. 

Los migrantes de Africa subsahariana representan el 45% de los diagnósticos nuevos que resultan de contactos heterosexuales [13]. La heterogeneidad en cuanto al origen de los individuos infectados se refleja en que se encuentran representados una multitud de subtipos y recombinantes de VIH. La confirmación de una exploración inicial reactiva para VIH está centralizada en 7 laboratorios de referencia que reportan los nuevos diagnósticos cifrados al instituto de Salud Pública. Los laboratorios de referencia también están a cargo del monitoreo de laboratorio de los pacientes infectados con VIH y como tal tienen acceso a los datos de carga viral y de recuento de CD4 para todos los pacientes que ingresan a atención. 

Se evaluaron los  siguientes marcadores de momento de la infección: ausencia de anticuerpos contra el antígeno p31 de VIH- 1 como se visualiza en la prueba confirmatoria de inmunoblot (INNO-LIA HIV I/II Score, Fujirebio, Ghent, Bélgica), concentración baja de IgG VIH como la define el inmunoensayo enzimático de incidencia SediaTM BED HIV-1 (BED-CEIA; Sedia Biosciences Corporation, Portland Oregón, EUA), baja avidez por anticuerpos de VIH como la define el inmunoensayo enzimático de avidez por el antígeno VIH-1 restrictivo (LAg-Avidity EIA; Sedia Biosciences Corporation). Se definieron las fortalezas y debilidades de dichos marcadores solos y en combinación en muestras seriadas de pacientes seroconvertidos o en muestras de pacientes con condiciones particulares y en muestras transversales de la población objetivo. Con base en los resultados obtenidos se desarrolló un árbol de decisión para la determinación futura del momento de la infección. 

Métodos 

Población estudiada

La Tabla 1 presenta una visión general de las características de los pacientes para las diferentes series de muestras. 

Tabla 1. Características de los pacientes en las diferentes series de muestras

Las series de muestras longitudinales comprendieron 237 muestras de plasma en serie de 42 pacientes con seroconversión documentada. El número promedio de muestras analizadas por paciente fue de 7 (intervalo de 4 a 15) y la media del periodo de seguimiento total fue de 696 días (intervalo 67 a 2364 días). La primera muestra recolectada de cada paciente (día 0) mostró una prueba reactiva para antígeno p24, pero no mostró anticuerpos detectables en el  INNO-LIA HIV I/II Score.

Las series de muestras transversales consistieron en muestras individuales recolectadas al momento del diagnóstico o máximo 6 semanas después, partir de ese punto, de 566 individuos diagnosticados con VIH-1 en Bélgica entre 2012 y 2014. En todos los casos los pacientes no habían recibido  tratamiento y tener una carga viral detectable (> 20 c/ml) al momento de la recolección de la muestra. El subtipo de VIH estaba disponible para 511 individuos, la mayoría (53.0%) estaban infectados con un subtipo B del virus. Los demás subtipos y formas recombinante circulantes (CFR)  representadas fueron CRF02_AG (n = 74), F (n = 63), A (n = 33), C (n = 26), CRF01_AE (n = 17), G (n = 11), otras CRF (n = 9) y D (n = 7). 

Las series de muestras de pacientes con una condición particular que se sabía estaba asociada con una probabilidad mayor de predicción del  proximidad de la infección falsa, contenían muestras individuales de 12 pacientes bajo tratamiento antirretroviral (TAR) (tratados durante al menos 6  meses, carga viral < 20 copias/ ml (c/ml)), de 11 controladores élite (infectados durante al menos 4 años, sin tratamiento, con carga viral entre 20 y  1000 c/ml) y de 19 infecciones avanzadas (infectados por más de 5 años, carga viral > 30,000 c/ml, recuento de CD4 < 100 células/mm3). 

Todas las muestras fueron seleccionadas del almacén de suero y plasma de los 7 laboratorios belgas de referencia para Sida. Este estudio fue aprobado por el Comité de ética de las instituciones participantes siendo el hospital Universitario de Ghent el centro líder (número de estudio 2014/0717). 

INNO-LIA y anticuerpos p31 

El ensayo INNO-LIA HIV I/II Score (Fujirebio) fue realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Usando la intensidad de banda de los  tres estándares internos, se calificó la reacción del anticuerpo a los antígenos individuales de VIH como -, ±, 1+, 2+ o 3+, ya fuera visualmente o por  el sistema de lectura automatizado LIRAS (Fujirebio). Los anticuerpos contra la proteína integrasa p31 se consideraron ausentes cuando se otorgaba una puntuación de – o de ± y presentes cuando la puntuación era de 1+ o mayor. Para las muestras longitudinales, el INNO-LIA se realizó  en muestras en serie hasta que se documentara la presencia de anticuerpos p31. Para las muestras de las poblaciones seleccionadas se realizó un  INNO-LIA en el contexto de este estudio, para las muestras transversales de pacientes recientemente diagnosticados se usaron los resultados del  ensayo diagnóstico. 

LAg-Avidity IEA y BED CEIA 

El SediaTM BED CEIA (Sedia Biosciences Corporation, Portland, Oregon, EUA) y el SediaTM HIV-a LAg-Avidity EIA (Sedia Biosciences  Corporation), se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se normalizaron usando un calibrador interno y se  reportaron como densidades ópticas normalizadas (DO-n). La atribución de infecciones de larga duración se basó en una sola medición y en una  DO-n > 1.2 para BED CEIA o > 2.0 para el LAg-Avidity EIA. Para muestras con una DO-n ≤ a sus respectivos valores de corte, se realizó un  preanálisis por triplicado como se recomienda y la discriminación entre la infección reciente y de larga duración se basó en una mediana de DO-n >  0.8 para BED CEIA y > 1.5 para LAg-Avidity EIA. 

Asignación del subtipo 

Se usaron secuencias de genes de proteasa y de transcriptasa inversa de VIH-1 agrupados con el fin de evaluar la resistencia basal para la  asignación del subtipo usando Rega v3, http://dbpartners.stanford.edu:8080/RegaSubtyping/ stanford-hiv/typingtool/ (Instituto Rega 
para la Investigación Médica, Lovaina, Bélgica) [14] y Comet, http://comet.retrovirology.lu/ (Laboratorio de Retrovirología, Instituto de Salud de  Luxemburgo, Luxemburgo) [15]. El subtipo sólo se asignó en caso de un resultado concordante de ambas herramientas y se consideró como  indefinido (UD) en caso de discordancia. Se asignaron a las secuencias los números ascendentes de Genbank MF754381 a MF754919. 

Análisis estadístico

Se usó la prueba de generalización extrema de la t de student de Rosner (ESD) con un nivel de significancia establecido en 0.05 para identificar los  típicos (https://www.medcalc.org/manual/outliers.php; último acceso el 29 de noviembre de 2007). Se usó la prueba exacta de Fisher para comparar  la representación de pacientes con un recuento bajo de CD4 contra las predicciones congruentes e incongruentes.  

Resultados 

Muestras en serie de seroconvertidos 

Para el estudio longitudinal, la fecha de recolección de la primera muestra (previo a la seroconversión) se consideró como día 0. Los anticuerpos  contra el antígeno p31 estuvieron ausentes en 28.7% de las muestras y fueron detectados por primera vez en una muestra recabada en el día 32. La mediana del intervalo temporal entre la última muestra sin anticuerpos p31 y la primera muestra con anticuerpos p31 fue el día 64.5 (IQR 33.5 –  89.0) (Fig. 1a). Con el LAg-Avidity EIA, 38.8% de las muestras en serie fueron clasificadas como recientes y 61.2% como de larga duración (Fig.1b).  Las muestras de infecciones recientes fueron recolectadas entre el día 0 y el 406. La mediana del punto de tiempo entre las clasificaciones de reciente y de larga duración fue el día 108.0 (IQR 89.5 – 157.5) (Fig. 1b). Con el BED CEIA, 50.0% de las muestras fueron clasificadas como  recientes y 50.0% como de larga duración (una muestra no fue analizada con el BED CEIA). Las infecciones recientes fueron recolectadas entre el día 0 y el 1053. La mediana del punto de tiempo entre la clasificación de reciente y de larga duración fue el día 169.5 (IQR 108.0 – 234.45) (Fig. 1c). 

Fig. 1 Resultados de la presencia del anticuerpo p31 (a), LAg-Avidity EIA, (b) BED CEIA (c) y el árbol de decisión (c) en seroconvertidos. Las  gráficas de dispersión representan la intensidad del p31 en las tiras INNO-LIA (a), la densidad óptica normalizada para el LAg-Avidity EIA (b), la  densidad óptica normalizada para el BED CEIA (c) y la clasificación del árbol de decisión (d) para 237 muestras de 42 seronconvertidos. La fecha de la primera muestra, recabada previo a la seroconversión, se considera como día 0. Los diamantes azules representan la clasificación como  infección reciente; los diamantes rojos representan clasificación como infección de larga duración. 

La Figura 2a representa la evolución de los resultados del ensayo través del tiempo en un paciente representativo (paciente PO). La prueba ESD de  Rosner identificó 7 atípicos para los anticuerpos p31, 3 para el LAg-Avidity EIA y 2 para BED CEIA. Se observó ausencia de anticuerpos p31 en muestras recolectadas en el día 89, 122, 167, 267, 386, 524 y 599 reflejando una producción retardada de anticuerpos p31 en 3 pacientes de  quienes fueron obtenidos: paciente 79 (Fig. 2b), paciente 83 (Fig. 2c) y paciente 09 (Fig. 2d). El LAg-Avidity EIA clasificó equivocadamente una  muestra recolectada en el día 0 como infección de larga duración: paciente GU (Fig. 2e) y 2 muestras recolectadas del paciente 83 en el día 214 y  406 como infección reciente (Fig. 2c) y una muestra del día 1053 (paciente 11, Fig. 2f) como infección reciente. 

Fig. 2. Resultados del ensayo en función del tiempo desde la recolección de la primera muestra para 6 pacientes demostrativos. a representa la evolución de los marcadores en un paciente representativo (PO) y de b a f representan la evolución en todos los pacientes con al menos un  resultado atípico. Estrellas negras: ausencia de anticuerpos p31; triángulos negros: presencia de anticuerpos p31. Círculos azules: resultados del  BED CEIA, círculos vacíos: infección reciente, círculos rellenos: infección de larga duración. Diamantes rojos: resultados del LAg-Avidity EIA;  diamantes vacíos: infección reciente, diamantes rellenos: infección de larga duración. Línea negra: evolución de la carga viral. Los cuadros en la  parte superior de las gráficas representan los resultados obtenidos cuando se siguió el árbol de decisión, amarillo: infección muy temprana,  anaranjado: infección temprana, verde: infección reciente, morado: infección de larga duración, y café: infección avanzada.

Los 5 pacientes con resultados atípicos estaban infectados con un subtipo B del virus. Tres de los 4 pacientes con una ventana de proximidad de la infección prolongada ya fuera para ambos EIAs y para los anticuerpos p31 (paciente 83, Fig. 2d), sólo para el BED CEIA (paciente 11, Fig. 2e) o solo para los anticuerpos p31 (pacientes 79, Fig. 2f) también mostraron un control viral pronunciado después de la infección aguda en ausencia de TARc. En la Tabla 2 se resume la sensibilidad global y la especificidad de los dos ensayos EIA cuando se aplican diferentes cortes para la duración de la infección. 

Tabla 2. Sensibilidad y especificidad de LAg-Avidity, BED y del árbol de decisión para muestras longitudinales de seroconvertidos. Se aplicaron  diferentes ventanas de infección reciente cambiando el corte para la duración de la infección. La duración de la infección es el periodo (en días)  después de la recolección de la primera muestra previa a la seroconversión. Infección reciente: muestras tomadas antes del corte establecido para  duración de la infección. Infección de larga duración: muestras tomadas en el corte para duración de la infección o después de este. Para el árbol de  decisión, todos los resultados de “muy temprana” o “temprana” fueron consideradas como recientes (clasificación 1) o todos los resultados de “muy  temprana”, “temprana” y “reciente” fueron consideradas como recientes (clasificación 2). 

Cabe hacer notar que 2 pacientes que iniciaron con TARc durante la fase aguda de la infección mostraron una ventana de proximidad de la infección prolongada para los 3 marcadores (analizado fuera del estudio, no se muestran los resultados). 

Controladores élite, pacientes con progresión lenta, tratados con TAR y pacientes con etapas tardías de la enfermedad 

Se observaron altas tasas de predicciones falsas de reciente en los pacientes recibiendo TAR y en controladores élite (Tabla 3), con el BED CEIA presentando la mayoría de este tipo de clasificaciones equivocadas, seguido del  Ag-Avidity EIA y de los anticuerpos p31. La enfermedad avanzada y un recuento bajo de CD4 también se asociaron con un mayor número de predicciones falsas de reciente en el BED CEIA y el ensayo de anticuerpos p31, pero no así en el LAg-Avidity (Tabla 3). No se observaron clasificaciones falsas de reciente para los pacientes con progresión lenta. 

Tabla 3. Predicciones falsas de proximidad de la infección en poblaciones especiales

Individuos recientemente diagnosticados 

En la Tabla 4 se muestran los  resultados de 566 muestras transversales de pacientes recientemente diagnosticados. Se obtuvieron clasificaciones de infección reciente  concordantes para los 3 marcadores para 105 (18.9%) pacientes y clasificaciones de infección de larga duración concordantes para 313 (55.3%), resultando en una concordancia global de 73.9%. 

Tabla 4. Resultados del momento de la infección para muestras transversales de 566 individuos recientemente diagnosticados

Al comparar los resultados de los dos EIAs, la concordancia fue de 85.3%, con 28.4% de las muestras clasificadas como infecciones recientes y 56.9% como infecciones de larga duración. Se observaron discordancias entre los resultados del EIA para 83 pacientes (14.7%), 82 clasificados  como recientes por BED y de larga duración por el LAg-Avidity y 1 clasificado como reciente por el LAg-Avidity y de larga duración por BED. 

Para los análisis subsecuentes, los resultados que siguieron las expectativas considerando las diferencias en la ventana de infección reciente entre los ensayos, se nombraron congruentes y los resultados que no pudieron explicarse por la ventana de infección reciente se nombraron incongruentes (Tabla 4). El número total de predicciones incongruentes fue bajo (n = 18, 3.2%) siendo que el número más alto resultó de predicciones falsas de infección reciente, 17 para anticuerpos p31, 8 para BED CEIA y 1 para LAg-Avidity EIA. 

Para identificar adicionalmente los motivos de las incongruencias, se compararon la carga viral y la distribución del subtipo entre los grupos de clasificación. Los resultados mostraron que las incongruencias se observaron en forma significativamente más frecuente en pacientes con un recuento bajo de CD4 (< 200 células/ mm3; p < 0.01) pero ni la influencia de la carga viral ni la del subtipo fueron significativas. Cabe hacer notar que 7 de los 9 pacientes clasificados como infecciones de larga duración por ambos EIAs, pero en quienes estuvieron ausentes los anticuerpos p31, fueron infecciones del subtipo B. 

Adaptación de los cortes para el reanálisis por triplicado 

El protocolo estándar para el BED CEIA y el LAg-Avidity EIA recomiendan el reanálisis por  triplicado para todas las muestras con una DO-n de ≤ 1.2 ≤ 2.0 respectivamente. El valor agregado de esta prueba confirmatoria fue investigado analizando el número de muestras con una conclusión  diferente después del análisis por triplicado a la obtenida si sólo se hubiera tomado en cuenta el resultado de la prueba realizada una sola vez. Éste fue el caso para 4 muestras para BED CEIA y 13 muestras para el LAg-Avidity EIA. Estas muestras tuvieron una DO-n de la prueba única entre  0.706 y 0.881 para el BED CEIA y entre 1.160 y 1.553 para el LAg-Avidity EIA. Por lo tanto, para el árbol de decisión nos sentimos confiados de estrechar el intervalo de la DO-n que requeriría de un reanálisis confirmatorio a ≤ 1.000 y > 0.700 para BED y ≤ 1.600 y > 1.100 para el LAg-Avidity. 

Árbol de decisión 

Con base en la información reunida se diseñó un árbol de decisión de múltiples ensayos para la determinación del momento de la infección en el  diagnóstico en pacientes que no hubiera recibido tratamiento con una carga viral detectable (Fig. 3). El paso inicial es la identificación de muestras  previas a la seroconversión (con INNO-LIA negativo o indeterminado) y la clasificación inmediata de estos pacientes como infecciones agudas.  posteriormente todas las muestras restantes son analizadas con el BED CEIA usando los cortes adaptados para el reanálisis por triplicado para  identificar infecciones de larga duración. Las muestras predichas por el BED CEIA como infectadas recientemente son entonces analizadas en el  LAg-Avidity EIA. Los resultados del LAg-Avidity se interpretan junto con la información sobre la presencia o ausencia de anticuerpos p31 para  identificar pacientes con una infección “muy temprana” (ambos EIAs indicando infección reciente, anticuerpos p31 aún ausentes) y pacientes con  infección “temprana” (ambos EIAs indicando infección reciente, anticuerpos p31 presentes). Las muestras con un pronóstico de BED de reciente –  LAg-Avidity de larga duración, son consideradas como recolectadas en una etapa de la infección ligeramente más avanzada llamada “reciente”. Esta última clasificación es más propensa a errores. Para reducir el número de clasificaciones de infecciones recientes falsas, las muestras en estas  categorías sin anticuerpos p31 o con un recuento de CD4 de < 100 células/mm3 son reclasificadas como infecciones presumiblemente avanzadas.  Considerando  las ventanas de infección reciente calculadas para ambos EIA y para anticuerpos p31 se estima que la clasificación de muy temprana represente infecciones de menos de 3 meses, la clasificación de temprana de menos de 4 meses y la clasificación de reciente de menos de 6  meses. Para las muestras en serie provenientes de seroconvertidos, el árbol de decisión fue capaz de identificar el momento de la infección con una  sensibilidad y especificidad idéntica o mayor a la sensibilidad y especificidad obtenida con los ensayos individuales. Los resultados obtenidos  después de la simulación del árbol de decisión para las muestras transversales se muestran en la Tabla 4. Para estas 566 muestras transversales, la aplicación del árbol de decisión hubiera reducido el número de pruebas individuales en un 29.8% y de los análisis por triplicado en un 84.2%  resultando en una reducción estimada de costos por muestra de 13.2 USD a 5.2 USD, sin pérdida de información. 

Fig. 3. Árbol de decisión para determinar el momento de la infección

Discusión 

La infección aguda por VIH-1 se caracteriza por la presencia de antígenos virales o de ARN viral en ausencia de anticuerpos específicos y puede ser reconocida fácilmente con base en los resultados de ensayos diagnósticos realizados en forma rutinaria [16]. 

El surgimiento secuencial de la reactividad en diferentes pruebas diagnósticas ha sido usado como una herramienta por Fiebig et al para establecer  la etapa de la infección primaria [17]. Sin embargo, la etapa aguda previa a la seroconversión es corta, considerándose que dura entre 12 y 99 días 18], y la mayoría de las infecciones son diagnosticadas posteriormente. Se ha dedicado un esfuerzo considerable para la validación de métodos o  estrategias que permitan una estimación confiable del momento de la infección en el diagnóstico posterior a la seroconversión. La bibliografía sobre este tema es amplia, pero carece de consistencia, con respecto a los métodos aplicados, los ensayos usados y la población de pacientes analizada. A pesar de muchos esfuerzos, aún hace falta un método de referencia aceptado en forma general para establecer el momento de la infección. Por lo tanto, cualquier iniciativa para la medición de la incidencia de VIH requiere de una validación apropiada de las estrategias potenciales en muestras recolectadas de la población objetivo, prevista. 

La meta del presente estudio fue desarrollar un método para establecer el  momento de la infección en pacientes recientemente diagnosticados con infección por VIH-1 en Bélgica. El objetivo fue encontrar una estrategia que permita la medición de la incidencia, pero también facultara el establecimiento confiable del momento de la infección en pacientes individuales. Esta  última debe facilitar una caracterización más profunda de los pacientes que ingresan a atención, una mejor identificación de los motivos  para un  diagnóstico tardío y una mejor comprensión del periodo durante el cual un paciente es más vulnerable para transmitir el virus a un tercero. Esta  información es importante para el seguimiento, ajuste y mejoría de los esfuerzos de prevención. 

Las diferencias individuales entre los pacientes y la composición de la población usada para la validación pueden, en cierto grado, influenciar la media de la ventana de infección reciente. Por ejemplo, observamos ventanas de infección reciente más prolongadas en pacientes que eran capaces de controlar la carga viral en un punto inferior en poco después de la infección. Los EIAs de incidencia de fabricantes diferentes pueden tener ventanas de infección reciente diferentes, incluso si están analizando el mismo parámetro y también puede diferir el método usado para el cálculo de la ventana de infección reciente 

Dado que la ventana de infección reciente impacta altamente las tasas de incidencia calculadas, esta es un factor esencial por considerar al decidir sobre el uso de un ensayo para el cálculo del momento de la infección. La ventana de infección reciente ideal para el cálculo de la incidencia es de un año, pero ninguno de los marcadores evaluados alcanzó ese tiempo límite. El DEB CEIA tiene la ventana de infección reciente más amplia y por  lo tanto parecer más adecuado, pero como observamos nosotros y otras personas, es también el ensayo con la tasa de infección reciente falsa más alta [22-24]. En una publicación reciente Kassanjee et al. sugirieron optimizar las ventanas de infección reciente de los inmunoensayos afinando los  umbrales [25]. Esta estrategia que también fue explorada por Konikoff et al. [26] amerita mayor exploración. 

Para minimizar las clasificaciones falsas, el fabricante del BED CEIA recomienda la exclusión de individuos recibiendo TAR, supresores élite e individuos con un recuento de CD4 < 200 células/mm3. mientras que nuestros hallazgos respaldan la importancia de excluir a los pacientes con una carga viral indetectable, el valor agregado de eliminar a los pacientes con un recuento de CD4 < 200 es debatible. A pesar de que esto eliminaría parte de las predicciones falsas de reciente en una infección avanzada [27], no las excluiría todas. Además, debido a que los recuentos de CD4 pueden caer ocasionalmente por abajo de las 200 células/mm3 después de la infección aguda [28,29], la exclusión de pacientes con un recuento bajo de CD4 puede impactar los números de infecciones recientes. Por lo tanto, optamos por reclasificar solamente como infecciones avanzadas a aquellos pacientes con un recuento de CD4 de menos de 100 células/mm3 que solo el BED CEIA consideró como infectados recientemente. Las predicciones de reciente falsas del BED EIA en etapa avanzada de la infección pueden explicarse por la reducción de concentración de anticuerpos de VIH con la progresión de la enfermedad [30]. Esta disminución en la concentración de anticuerpo también puede llevar a la desaparición de los anticuerpos p31, pero parece tener poco efecto sobre la afinidad por los anticuerpos en general. Por lo tanto, las predicciones de reciente falsas en los pacientes con una etapa tardía de la enfermedad son raras para el LAg-Avidity EIA [7, 19, 31]. En el árbol de decisión, la ausencia de anticuerpos p31 en pacientes considerados como recientemente infectados sólo por BED CEIA se considera indicativo de una etapa avanzada de la infección. Sin embargo, no podemos excluir que aquellos pacientes que no montan una respuesta de anticuerpos p31 o con una producción tardía de anticuerpos p31 como un paciente en el estudio longitudinal, sean considerados falsamente como teniendo una enfermedad avanzada, pero dado que esto se considera un fenómeno raro creemos que este error potencial no sobrepasa la ganancia global en la confiabilidad del cálculo del momento de la infección. 

La elección del BED CEIA en primera línea se justifica por su alta confiabilidad para la identificación de infección de larga duración y su bajo precio  (aproximadamente  450 USD por kit contra 650 para el LAg-Avidity EIA). El uso del BED CEIA en primera línea también permite beneficiarse de la ventana de infección reciente más amplia de este ensayo y proporciona una forma para discriminar entre las infecciones “tempranas” y “recientes”.   Las clasificaciones de infección “muy temprana” o “temprana” siempre se basarán en un pronóstico de infección reciente obtenido por ambos EIAs y  por lo tanto serán altamente confiables. La clasificación de infección “reciente” se basará únicamente en un pronóstico de infección reciente del BED  CEIA un ensayo con una tasa de infección reciente falsa elevada. A pesar de la corrección para predicciones de infección reciente falsa basada en el recuento de CD4 y en la presencia o ausencia de anticuerpos p31 esta categoría puede sufrir de algunas clasificaciones erróneas. Para este estudio  a información sobre la presencia o ausencia de anticuerpos p31 se deduce del ensayo confirmatorio INNO-LIA. Necesitaría  examinarse si el ensayo inmunocromatográfico más recientemente desarrollado, Ensayo suplementario GeeniusTM HIV ½ (Biorad, Marnes-la-Coquette, Francia) puede servir para este fin. 

Este estudio fue desarrollado en un país con una epidemia de VIH heterogénea [13, 32]. Existen algunos reportes acerca de diferencias relacionadas con el subtipo en el desempeño de los EIAs de incidencia, más particularmente se ha descrito una alta frecuencia de pronósticos de reciente falsos realizados por el BED CEIA en el subtipo D [33, 34]. Nosotros no encontramos indicaciones de la influencia del subtipo sobre el  momento de la infección, pero la contribución del subtipo D fue baja. De las 7 infecciones de subtipo D, 3 fueron pronosticadas como de larga duración, 1 como muy temprana y 1 como reciente. Inesperadamente, se observó una mayor contribución de las infecciones de subtipo B entre los pacientes pronosticados como infectados durante largo tiempo por ambos EIAs pero que carecían de anticuerpos p31. La sobrerrepresentación del  subtipo B en estos pacientes con una enfermedad avanzada presumible no fue estadísticamente significativa, pero justifica una ulterior investigación.

Cualquier medición de incidencia que se base en características específicas de la respuesta inmune humoral estará propensa error debido a la  variabilidad natural en la producción y maduración de anticuerpos. Se ha sugerido a la cuantificación de la variabilidad genética del virus como un  marcador alternativo del momento de la infección [35] pero los métodos para definir la variabilidad genética son complicados y difíciles de  estandarizar y puede esperarse que el grado de evolución genética también varíe significativamente entre los individuos. 

Anteriormente se han presentado algoritmos de análisis para la medición de la incidencia de VIH [12, 36]. Usando esta metodología desarrollamos un árbol de decisión que, con un esfuerzo y costos limitados, combine la exactitud y la precisión para definir el momento de la infección por VIH-1 en muestras individuales. 

Conclusión 

Tomando en cuenta las fortalezas y debilidades de los diferentes marcadores del momento de la infección, se estableció un árbol de decisión paso a  paso que permite clasificar, en el momento del diagnóstico, una infección por VIH como muy temprana (infección de hace menos de 3 meses), temprana (de hace menos de 4 meses), y reciente (de hace menos de 6 meses). El ser capaces de discriminar estas fases de la infección temprana  será un recurso importante en los estudios cuyo objetivo sea analizar la dinámica de las epidemias locales y los efectos de las estrategias de  prevención. 

Abreviaturas TAR: tratamiento antirretroviral; BED: antígeno de VIH subtipo B, E y D; CD4 Clúster de diferenciación 4, CEIA: inmunoensayo  enzimático de captura; EIA: inmunoensayo enzimático; ESD: desviación extrema de la t de Student; VIH: virus de inmunodeficiencia humana; INNO-LIA: inmunoensayo lineal de Innogenetics, IQR: rango interquartil, DO: densidad óptica; DO-n: densidad óptica normalizada; P24: proteína 24 de VIH (proteína de la cápside): P31 proteína de VIH (íntegrasa), ONUSIDA: Programa de las Naciones Unidas sobre VIH/SIDA; USD: Dólar estadounidense. 

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